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牛乳中蛋白質的提取與鑒定

   日期:2013-09-23     來源:實驗室資訊網    瀏覽:38575    
  一、目的
學習從牛乳中制備酪蛋白的原理和方法。
二、原理
牛乳和羊乳中含豐富的蛋白質,其中主要是酪蛋白。酪蛋白在羊乳罩中約占總蛋白量3/4,牛乳中約占總蛋白量的5/6。酪蛋白是一種含磷蛋白的不均一混合物。
蛋白質在其等電點pH 溶液中溶解度降底。根據這個原理,將牛乳的PH調整至4.8,即酪蛋白的等電點時,酪蛋白即沉淀出來。用乙醇除去酪蛋白沉淀中不溶于水的脂肪,得到純的酪蛋白。所得酪蛋白供定性鑒定。
除去酪蛋白的濾液中,尚含有球蛋白,清蛋白等多種蛋白質。
試劑
1、醋酸鈉緩沖液(0.2M pH4.6)。
2、米倫(Millon)試劑:將汞100g 溶于140ml(比重1.42)的濃硝酸中(在通風櫥內進行)。然后加兩倍量的蒸餾水稀釋。
3、95%乙醇
.
5、10%NaGl.
6、0.5%NaGO
7、0.1NaON
8、0.2%HC1.
9、飽和氫氧化鈣[Ca(OH)]
10、5%醋酸鉛
三、操作
(一)酪蛋白的制備取新鮮牛乳100ml,放入250 ml 燒杯中加熱至40℃.加入100ml 加熱至同樣溫度的醋酸緩沖液,一邊加一邊搖動,并用pH為4.7(用1%NaOH 或10%醋酸進行調整)。冷卻至室溫,繼續放置5 分鐘,然后用細紗布或濾紙過濾。濾液為乳清保留以下做鑒定。過濾所得沉淀物,用少量蒸餾水洗幾次,過濾。將洗凈的沉淀物懸浮在約30ml 乙醇中,
用布氏漏斗抽濾。所得沉淀用乙醇和等量混合液洗滌兩次,抽干。最后用50ml 洗一次并抽干。取出抽干的粉狀物,攤開在表面皿上, 使完全揮發。稱其干重計算其產量。
(二)酪蛋白的性質鑒定
1.溶解度:取試管6 支,分別加水、10%氯化鈉、0.5%氯化鈉,0.1N 氫氧化鈉、0.2%鹽酸及飽和氫氧化鈣溶液各2ml。于每管中加入少量酪蛋白。不斷搖蕩,觀察并記錄各管中的酪蛋白溶解度。
2、米倫反應1:取酪蛋白少許,放置于試管中。加入1ml 蒸餾水,再加入米論試劑10 滴,振搖,并徐徐加熱。觀察其顏色變化。
3、含硫(胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸)測定:取少量酪蛋白溶于1ml0.1N NaOH 溶液中,再加入1-3 滴5%醋酸鉛,加熱煮沸,溶液變為黑色。
(三)乳清中可凝固性蛋白質的鑒定將制備酪蛋白時所得的濾液移入燒杯中,徐徐加熱。即出現蛋白質沉淀。此為乳清中的球蛋白和清蛋白。注附:米倫反應是由于蛋白質分子中有羥基苯基(-CH-OH)存在之故.一些在3.5 位置上沒有取代基的酚類化合物,例如酪氨酸、酚及廱香酚也呈陽性反應。在蛋白質分子中,只有酪氨酸才具有羥基苯基,所以蛋白質對米倫試劑起陽性反應。
 
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