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Lowry–Folin法测定液体样品中蛋白质含量

   日期:2013-09-23     来源:实验室资讯网    浏览:39120    
 一、 实验目的
1、 了解测定蛋白质的常用方法
2、 掌握蛋白质含量测定的经典Lowry – Folin法。
二、 实验原理
在碱性溶液中,蛋白质中的肽键与铜盐可产生双缩脲反应,产生络合物,此络合物会将磷钼酸-磷钨酸试剂还原,产生深蓝色复合物。在一定的条件下,蓝色深浅与蛋白质的量成正比。在波长540nm处测定样品的吸光度,与标准曲线对比,可确定其蛋白质含量。这种方法是检测可溶性蛋白质含量最灵敏的经典方法之一。
三、 实验步骤
1、 标准曲线的绘制
(1) 取10ml具塞试管6支,编号,分别准确吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00ml血清蛋白溶液置于相应的试管中,在各试管中分别加入1.00、0.80、0.60、0.40、0.20和0.00ml的蒸馏水,使总体积达到1.00ml。不同浓度BSA 溶液的配置
编号 0(空白) 1 2 3 4 5
BSA (ml) 0 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00
水(ml) 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0
BSA 质量(µg) 0 40 80 120 160 200
(2) 取试剂A15.00ml,试剂B0.75ml和试剂C0.75ml,在50ml三角瓶中混匀,在每只试管中分别准确加入此试剂1.00ml,充分摇匀,静置15min.
(3) 分别在各试管中准确加入Folin-酚试剂稀释液3.00ml,立刻震荡,充分摇匀。
(4) 静置30min,在540nm波长下测定每个试管中溶液的吸光度(A值)。
(5) 以A值为纵坐标,BSA 质量(即0~200µg)为横坐标,绘制标准曲线,求出回归方程和相关系数R2。
2、 样品的测定
将啤酒样品适当稀释(20倍),吸取2份,各1.00ml,重复步骤1中的(2)~(4)。
四、 实验试剂
1、 试剂A:称取Na2CO3100.0g溶于1000ml(最终体积)0.5mol/LNaOH中。
2、 试剂B:称取CuSO4·5H2O1.0g溶于100ml(最终体积)蒸馏水中。
3、 试剂C:称取酒石酸钾钠2.0g溶于100ml(最终体积)蒸馏水中。
4、 牛血清蛋白 (BSA)标准溶液:准确称取牛血清蛋白,配制成浓度为200µg/ml的溶液。
5、 2mol/LFolin-酚试剂。
五、 实验数据与处理
分组 0(空白) 1 2 3 4 5 样品1 样品2
吸光度 0.000 0.073 0.157 0.216 0.273 0.341 0.172 0.164
样品中蛋白质的含量(µg/ml) = XA Ⅹ N Ⅹ 0.001
式中,XA——根据标准曲线计算出来的蛋白质量(对应稀释样品中的蛋白质浓度,µg/ml) N——样品的稀释度数(N=20)
计算:标准曲线 y = 0.0017x + 0.0078(R2=0.9957)
当y1=0.172时,代入得x1=96.59(µg/ml)样品1中蛋白质含量m1=1.93mg/ml
当y1=0.172时,代入得x1=96.59(µg/ml)样品1中蛋白质含量m1=1.93mg/ml
当y2=0.164时,代入得x2=91.88(µg/ml)样品2中蛋白质含量m2=1.84mg/ml
平均含量:(1.93+1.84)/2=1.885 mg/ml
平均偏差:(1.93-1.84)/2 = 0.045
相对平均偏差:0.045/1.885 Ⅹ 100% = 2.39%
六、 实验注意事项
1、 加入Folin-酚试剂后立即将反应液摇匀,以便Folin-酚试剂在碱性溶液中破坏之前即能被铜-蛋白质复合物还原。
2、 短时间内反应液的颜色保持稳定,因此,静置30min后应立即测定吸光度,若拖延时间过长,颜色将会变化,影响测定结果。
七、 思考题
1、 测定食品中蛋白质含量的常用方法有哪些?其原理、适用性如何?
答:①凯氏定氮法
原理:样品与浓硫酸共热,含氮有机物即分解产生氮(消化),氮又与硫酸作用,变成硫酸氢。经强碱碱化使之分解放出氢气,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和的程度可计算得样品的氮含量,再乘以6.25,即得样品中蛋白质含量,以甘氨酸为例,反应式为:
NH2CH2COOH + 3H2SO4——2CO2+3SO2+4H2O+NH3
2NH3+H2SO4——(NH4)2SO4
(NH4)2SO4+2NaOH——2H2O+NaSO4+2NH3
适用性:用于标准蛋白质含量的准确测定,干扰少,费事太长;灵敏度低,适用于0.2~1.0mg氮,误差为±2%。
②双缩脲法
原理:在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或连个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测量蛋白质含量。
适用性:用于快速测定,但不太灵敏;不同蛋白质显色相似;误差范围为1~10µg蛋白质
③Folin-酚试剂法
原理:在碱性溶液中,蛋白质中的肽键与铜盐可产生双缩脲反应,产生络合物。此络合物会将磷钼酸-磷钨酸试剂还原,产生深蓝色复合物。在一定的条件下,蓝色深浅与蛋白质的量成正比。在波长540nm处测定样品的吸光度,与标准曲线对比,可确定其蛋白质含量。
适用性:耗时长,操作要严格计时;颜色深浅随不同蛋白质变化,灵敏度高;最低位0~5µg;通常测定范围是20~250µg;也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。
④紫外吸收法
原理:蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有紫外吸收的性质,吸收峰在280nm处,其吸光度与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在280nm时的吸光度值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的吸光度值与蛋白质浓度的正比关系,可进行蛋白质含量的测定。
适用性:用于层析注流出液的检测;较为灵敏50~100µg;适用于与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。
⑤考马斯亮蓝法
原理:考马斯亮蓝G-250染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使燃料的最大吸收峰位置λmax,由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色,在595nm下测定的吸光度值,与蛋白质浓度成正比。
适用性:干扰物质少,颜色稳定,颜色深浅随不同蛋白质变化;灵敏度最高为1~5µg。
2、 使用分光光度计时应注意哪些问题?
答:分光光度计特点:准确度高,测量范围广,在一定条件下可同时测定水样中两种或两种以上的物质组成含量。
注意:①使用前,仔细阅读其使用说明书;②若大幅度改变测试波长,需稍等片刻,等灯热平衡后,重新调零及满度后,再测量;③指针式仪器在未接通电源时,电表的指针必须位于零刻度,若不是,则需进行机械调零;④操作人员不宜轻易触动灯泡及反光镜灯,以免影响光效率;⑤放大其灵敏度换挡后,必须重新调零;⑥比色皿使用时需注意方向性,并应配套使用,以延长其使用寿命,使用完毕后,应立即用蒸馏水冲洗干净,并用干净柔软的纱布擦水迹,以防表面光洁度被破坏。
 
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